1 Culture the cell line in complete

1 Culture the cell line in complete culture medium (F12 medium cotining 10% FBS.1X penicillin 1 mM GlutaMax.10 ug/ml blasticidin 200 ug/ml zeocin) at 37c, 5%(v)CO²,overnight.On the follwing day. induce cells with 1 ug/ml of doxycycline for 24 hrs.On the day of the assay. dilute 5X Stim B buffer with ddH2O to make 1X Stim B.2 Prepare the compound as described above.Detach cells by removing media and adding 5 ml Accutase/T-225 flask and incubate at 37℃ for 3 minutes4 Add 10 ml complete culture medium to stop the rcaction and pellel cells by centrifuging at 300 for 5 minutes.5 Resuspend cels in 2 ml of Ix stim B and then pass through 100 micron cel strainer (to break up bigger chumps).6 Count cels density and viability by using cell counter. Only cels with >85% viability are used for the assay.7 Dilute cll to 3* 10 cll with the IX Stim B Seed cel at a density of 30,000 cll/ll in 384 well plates.8 Centrifuge the cell plate at 10000 rpm for I min and then agitate at 600 rpm for 2 min Incubate the plate at 37"C for 60 min.9 Prepare the IP1-d2 working solution and ati-lPl-rptate working solution ollowing the table bclow.10 Mix equal amount of IP1-d2 and at-lPlcryptate working solution to make dettion mix.11 Add 10 ulwell of detection mix to plates, Centrifuge the plate at 1000 rpm for I min and then agitate at 600 rpm for 2 min.12 Incubate for 1 hour at room temperature in the dark and read the plate by using an EnVison microplate reader (lex 320 nm, Àem *615 nm and 665 nm).

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1将细胞系在37°C，5％（v）CO2的完整培养基（含10％FBS.1X青霉素1 mM GlutaMax.10 ug / ml杀菌素200 ug / ml zeocin的完全培养基）中过夜培养。。用1 ug / ml强力霉素诱导细胞24小时。 在检测当天。用ddH2O稀释5X Stim B缓冲液以制成1X StimB。2 如上所述制备化合物。 通过除去培养基并加入5 ml Accutase / T-225烧瓶来分离细胞，并在37℃下孵育3分钟 。4加入10 ml完全培养基，以300离心5分钟以终止反应和pellel细胞。 5在2 ml Ix刺激物B中重悬细胞，然后通过100微米cel过滤器（分解更大的块）。 6使用细胞计数器计数细胞密度和生存力。该测定仅使用存活率> 85％的细胞。 7用IX Stim B Seed cel在384孔板上以30,000 cll / ll的密度将IX Stim B Seed cel稀释至3 * 10 cll。 8将细胞板以10000 rpm的速度离心1分钟，然后以600 rpm的速度搅拌2分钟。将板在37“ C孵育60分钟 。9按照下表，准备IP1-d2工作溶液和ati-lPl-rptate工作溶液bclow。10 将等量的IP1-d2和at-Plcryptate工作溶液 混合以形成检测混合物11将10 ulwell的检测混合物加入板中，以1000 rpm离心板1分钟，然后以600 rpm搅拌2分钟。 12在黑暗中于室温下孵育1小时，然后使用EnVison微孔板读取器（lex 320 nm，λem* 615 nm和665 nm）读取板。

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1 培养完整的培养基培养细胞系（F12 培养 10% FBS.1X 青霉素 1 mM GlutaMax.10 ug/ml 氨基丁 200 ug/ml 沸青素）在 37c， 5%（v） CO2，过夜。在愚昧的一天。诱导细胞与1 ug/ml的多氧环素24小时。 在测定当天。用 ddH2O 稀释 5X Stim B 缓冲液，使 1X Stim B. 2 如上文所述准备化合物。 通过去除介质并加入 5 ml Accutase/T-225 烧瓶分离细胞，并在 37°C 下孵育 3 分钟 4 添加10ml完整的培养培养素，通过离心在300离心5分钟来停止细胞的离心。 5 在 2 ml 的 Ix 刺激 B 中重新发送 cels，然后通过 100 微米 cel 过滤器（分解更大的块）。 6 使用单元格计数器计算 cel 的密度和可行性。只有具有>85%生存能力的cels用于测定。 7 稀释 cll 至 3* 10 cll 与 IX Stim B 种子 cel 在 384 孔板的密度为 30，000 cll/ll. 8 以 10000 rpm 的 I 分钟离心电池板，然后在 600 rpm 下搅拌 2 分钟，在 37°C 下孵育电池板 60 分钟。 9 准备 IP1-d2 工作解决方案和 ati-lPl-rptate 工作解决方案，使表 bclow。 10 混合等量的 IP1-d2 和 at-lPlcryptate 工作解决方案，使解吸混合。 11 向板中加入 10 ulwell 检测混合物，以 1000 rpm 的 I 分钟离心板，然后在 600 rpm 下搅拌 2 分钟。 12 在黑暗中室温下孵育 1 小时，并使用 EnVison 微孔板读取器读取板（lex 320 nm、[ em *615 nm 和 665 nm）。

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