ຮອງລັດຖະມົນຕີກະຊວງການຕ່າງປະເທດ ສໍາເ

2.2.8. Western blot <br>1、细胞接种与转染<br>（1）种子板：将MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞（分别为实验组和对照组）接种于六孔板中，静置至细胞培养箱中. 置于培养物中 24 小时；<br>(2) 孔板中细胞达到70%左右后转染，转染步骤同RNA干扰实验；<br>2. 提取蛋白（冰上操作）<br>(1) 将旧培养物滴入六孔板中。用4℃预冷的PBS洗涤3次，弃去PBS缓冲液，将细胞板置于冰上；(2)<br>制备裂解液(裂解液：PMSF=100:1)，加至六。- 孔板移液器数次使细胞裂解物和细胞完全混合并置于冰上30分钟以裂解；<br>(3)用细胞刮刀将细胞刮到一侧，转移到EP管中，在4℃离心机中12,000rpm离心10分钟；<br>(4) 离心后，收集上清液，即将蛋白转移至新的EP管中，记录总体积，-20℃冰箱保存。3、<br>BCA法测定蛋白质浓度<br>(1)按体积比A液：B液=50：1配制适量BCA工作液，充分混匀；(2) 完全<br>溶解蛋白标准品（BSA），用PBS缓冲液稀释，配制终浓度为0.5 mg/ml的标准蛋白工作液， - 20℃保存；(3)按实验方案加入稀释后的蛋白<br>. 将标准96孔板按预定的浓度梯度加入标准孔中，加入PBS定容至一定体积并做标记；(4)<br>取适量蛋白样品加入。从96孔板中取样，加入与标准孔等体积的PBS并记录；(5)<br>向所有孔中加入适量的BCA工作液，在摇床上摇匀，在摇床上室温孵育30分钟。<br>(6)用酶标仪在562nm处测定OD值，绘制标准曲线，由标准曲线计算蛋白样品的浓度；<br>(7) 根据测定浓度进行调整，取蛋白上样体积比：5×蛋白电泳上样缓冲液=4：1，加入5×蛋白电泳上样缓冲液，混匀；(8) 搅拌 将溶液煮沸<br>。100℃8分钟，冷却至室温，-80℃冰箱保存<br>4、聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）<br>（1）按照规定制备浓度为8%的分离胶和浓缩胶测试说明；<br>(2)) 放置玻璃板，倒入凝胶，等待凝胶凝固（分离凝胶凝固时间：30分钟，浓缩凝胶凝固时间：40分钟）；(3)<br>将玻璃板置于电泳槽中，加入1x电泳缓冲液并准备上样，将市售和蛋白样品加入进样口；(4) 连接<br>电源并将电压设置为80V。30分钟后，样品基本进入分离胶（marker指示剂上线已经移到浓缩胶和分离胶的分界线以下），加电压。120V，约40分钟后样品到达分离胶底部时，关闭电源，停止电泳<br>5.涂膜<br>(1)电泳结束前，将滤纸和PVDF膜按凝胶的大小。将滤纸、海绵、转移夹放入1x转移缓冲液中浸泡10分钟，PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分钟，然后将PVDF膜转移至1x转移缓冲液中浸泡10分钟；(2)<br>从电泳槽中取一块可拆卸的玻璃板，剪掉转移液最上面的浓缩胶，剪掉含有目的条带的分离胶；(3) 按<br>“海绵+滤纸×2+PVDF膜+凝胶+滤纸×2+海绵”，然后贴上转移夹。海绵和滤纸叠放时，应继续压平，排除空气，里面有气泡，并不断将转移缓冲液倒在夹具上，防止胶水干涸；(4) 插入组装好的转移夹 Transfer<br>用 1x 转移缓冲液填充膜罐中的罐。将转印槽置于冰盒中，接通电源，设置合适的电压和时间，开始转印（转印时间视目的蛋白大小而定）；6.洗<br>膜<br>(1) 转膜完成后，关闭电源，取出PVDF膜，放入培养箱中；(2)<br>用适量的1×TBST溶液在摇床上洗涤3次，每次10分钟（每次更换1×TBST溶液）和PVDF膜

ຮອງລັດຖະມົນຕີກະຊວງການຕ່າງປະເທດ ສໍາເລັດການຢ້ຽມຢາມທາງການປະເທດຍີ່ປຸ່ນ

是的,是的,是的