Immunofluorescence analysis of mous

Immunofluorescence analysis of mouse tissuesTo analyze vascular morphogenesis in the neonatal retina, eyes were dissected and fixed in 4% paraformaldehyde (Sigma) for 1 h on ice, washed in PBS before dissection of retinas. After blocking in TNB buffer (0.5% blocking reagent (PerkinElmer, FP1012), 150 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.4% Triton X-100) for 2 h at room temperature, the retinas were incubated with Alexa-Fluor-conjugated isolectin B4 (Invitrogen, I21411, 20 μg ml−1 in TNB) and primary antibody (if required) overnight at 4 °C. Anti-collagen IV (AbD Serotec, 2150–1470, 1:400), anti-ERG (Abcam, Ab92513, 1:200) or FOXO1 (Cell Signaling Technology, 2880, 1:100) and then Alexa-Fluor 546-conjugated secondary antibody (Invitrogen, 1:400) were applied in sequence. Afterwards, retinas were flat-mounted with Fluromount-G (Invitrogen) and examined by Olympus FV1000 or Zeiss LSM 710 confocal microscope. To label the proliferative endothelial cells with EdU, pups were injected i.p. with 60 μl EdU (Invitrogen, C10338, 0.5 mg ml−1 in PBS) 3 h before experiments. EdU detection was performed by Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging (Invitrogen, C10338). Retinas were stained by In Situ Cell Death Detection Kit TMR red (Roche) as the manufacturer’s instruction for determination of apoptotic ECs.In implanted tumor assays, mouse tissues were fixed in 4% paraformaldehyde overnight at 4 °C, washed in PBS, equilibrated in 30% sucrose overnight, embedded in OCT (Sakura), and sectioned at 5 μm. Slides were treated with 0.2% Triton X-100 in PBS and incubated in blocking solution (1% BSA, 5% goat serum in PBS) for 1 h at room temperature. Primary antibodies anti-CD31 (BD Biosciences, 553370, 1:200) and anti-collagen IV (AbD Serotec, 2150–1470, 1:200) were incubated overnight at 4 °C, followed with Alexa-Fluor 488- and Alexa-Fluor 546-conjugated secondary antibody (Invitrogen, 1:400) stainings for 2 h at room temperature. Samples were stained by DAPI solution for nuclei and then mounted by Fluromount-G. Slides were examined by Olympus BX-53 upright or Zeiss LSM 710 confocal microscope. Image analysis was accomplished with ImageJ. To assess tumor vessel density, CD31- positive area was measured and normalized with the tumor area. For analysis of vessel regression, the collagen IV-positive area was measured and divided by the CD31-positive area as previously reported24.

Immunofluorescence analysis of mouse tissuesTo analyze vascular morphogenesis in the neonatal retina, eyes were dissected and fixed in 4% paraformaldehyde (Sigma) for 1 h on ice, washed in PBS before dissection of retinas. After blocking in TNB buffer (0.5% blocking reagent (PerkinElmer, FP1012), 150 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.4% Triton X-100) for 2 h at room temperature, the retinas were incubated with Alexa-Fluor-conjugated isolectin B4 (Invitrogen, I21411, 20 μg ml−1 in TNB) and primary antibody (if required) overnight at 4 °C. Anti-collagen IV (AbD Serotec, 2150–1470, 1:400), anti-ERG (Abcam, Ab92513, 1:200) or FOXO1 (Cell Signaling Technology, 2880, 1:100) and then Alexa-Fluor 546-conjugated secondary antibody (Invitrogen, 1:400) were applied in sequence. Afterwards, retinas were flat-mounted with Fluromount-G (Invitrogen) and examined by Olympus FV1000 or Zeiss LSM 710 confocal microscope. To label the proliferative endothelial cells with EdU, pups were injected i.p. with 60 μl EdU (Invitrogen, C10338, 0.5 mg ml−1 in PBS) 3 h before experiments. EdU detection was performed by Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging (Invitrogen, C10338). Retinas were stained by In Situ Cell Death Detection Kit TMR red (Roche) as the manufacturer’s instruction for determination of apoptotic ECs.In implanted tumor assays, mouse tissues were fixed in 4% paraformaldehyde overnight at 4 °C, washed in PBS, equilibrated in 30% sucrose overnight, embedded in OCT (Sakura), and sectioned at 5 μm. Slides were treated with 0.2% Triton X-100 in PBS and incubated in blocking solution (1% BSA, 5% goat serum in PBS) for 1 h at room temperature. Primary antibodies anti-CD31 (BD Biosciences, 553370, 1:200) and anti-collagen IV (AbD Serotec, 2150–1470, 1:200) were incubated overnight at 4 °C, followed with Alexa-Fluor 488- and Alexa-Fluor 546-conjugated secondary antibody (Invitrogen, 1:400) stainings for 2 h at room temperature. Samples were stained by DAPI solution for nuclei and then mounted by Fluromount-G. Slides were examined by Olympus BX-53 upright or Zeiss LSM 710 confocal microscope. Image analysis was accomplished with ImageJ. To assess tumor vessel density, CD31- positive area was measured and normalized with the tumor area. For analysis of vessel regression, the collagen IV-positive area was measured and divided by the CD31-positive area as previously reported24.

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小鼠组织的免疫荧光分析 为了分析在新生儿视网膜血管形态发生，眼睛被解剖并在冰上1个小时，视网膜的解剖前在PBS中洗涤固定在4％多聚甲醛（Sigma）中。在TNB缓冲封闭后（0.5％封闭试剂（珀金埃尔默，FP1012），150mM NaCl的，100毫摩尔Tris-HCl（pH为7.4），0.4％的Triton X-100）在室温下2小时后，将视网膜用Alexa孵育-Fluor共轭的同工凝集素B4（Invitrogen公司，I21411，20微克毫升-1在TNB）和（如果需要）的第一抗体在4℃过夜℃。抗胶原蛋白IV（ABD Serotec公司，2150至1470年，1：400），抗ERG（Abcam公司，Ab92513，1：200）或FOXO1（Cell Signaling Technology公司，2880，1：100）和然后的Alexa-546氟 - 缀合次级抗体（Invitrogen，1：400）的序列被应用。然后，视网膜平面安装有Fluromount-G（Invitrogen）和由Olympus FV1000或蔡司LSM 710共焦显微镜检查。以标记增殖的内皮细胞用EdU，幼仔ip注射60微升的EdU（Invitrogen公司，C10338，0.5毫克ml-1的在PBS中）在实验前3小时。通过点击-IT的EdU细胞增殖试剂盒用于成像（Invitrogen公司，C10338）进行检测的EdU。视网膜是由原位细胞死亡检测试剂盒TMR染成红色（Roche）的作为制造商的用于测定细胞凋亡的EC的指令。 在植入肿瘤试验中，小鼠组织在4℃下固定在4％多聚甲醛过夜，在PBS中洗涤，在30％蔗糖中平衡过夜，包埋在OCT（樱），并在5微米切片。载玻片用处理0.2％的Triton X-100的PBS，并在室温下阻断1个小时溶液（在PBS中1％BSA，5％山羊血清）孵育。一抗抗CD31（BD Biosciences公司，553370，1：200）和抗胶原IV（ABD Serotec公司，二一五○年至1470年，1：200），在4℃温育过夜，然后用Alexa-488氟和Alexa-氟546缀合的二级抗体（Invitrogen，1：400）染色，在室温下2小时。样品通过对细胞核的DAPI溶液染色，然后安装在由Fluromount-G。载玻片由Olympus BX-53直立或蔡司LSM 710共焦显微镜检查。图像分析与ImageJ的完成。为了评估肿瘤血管密度，CD31-阳性面积进行测定，与肿瘤面积归一化。对于血管退化的分析，胶原IV阳性面积进行测定，由CD31阳性面积除以如先前reported24。

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小鼠组织的免疫荧光分析 为了分析新生儿视网膜的血管形态，对眼睛进行解剖，在4%的甲醛（西格玛）中固定在冰上1小时，在视网膜解剖前在PBS中洗涤。在TNB缓冲液中阻断后（0.5%阻塞试剂（PerkinElmer， FP1012），150 mM NaCl，100 mM Tris-HCl （pH 7.4），0.4% Triton X-100），在室温下孵育 2 小时，用 Alexa-Fluor 结合的等子素 B4（Invitrogen， I21411， 20 μg ml=1 inin）孵育TNB）和原抗体（如果需要）在4°C下过夜。抗胶原体IV（AbD Serotec，2150–1470，1：400），抗ERG（Abcam，Ab92513，1：200）或FOXO1（细胞信号技术，2880，1：100），然后Alexa-Fluor 546-结合二次抗体（Invitrogen，1：400）在序列中应用。之后，视网膜与Fluromount-G（Invitrogen）平装，由奥林巴斯FV1000或蔡司LSM 710共聚焦显微镜检查。为了用EdU标记增殖性内皮细胞，在实验前3小时给幼崽注射60μl EdU（Invitrogen，C10338，0.5mg ml+1在PBS中）。EdU 检测由 Click-iT EdU 细胞增殖工具包执行成像（Invitrogen，C10338）。视网膜被原位细胞死亡检测包TMR红色（Roche）染色，作为制造商测定凋亡的ECs的指示。 在植入的肿瘤测定中，小鼠组织在4°C过夜固定在4%的甲醛中，在PBS中洗涤，在30%蔗糖中平衡过夜，嵌入OCT（樱花），切片为5μm。在PBS中用0.2%Triton X-100进行幻灯片处理，并在室温下孵育出阻断溶液（1%BSA，PBS中的5%山羊血清）。抗CD31（BD生物科学，553370，1：200）和抗胶原体IV（AbD Serotec，2150–1470，1：200）在4°C孵育过夜，随后与Alexa-Fluor 488-和Alexa-Fluor 546-结合二次抗体（英特根，1：400）在室温下染色2小时。样品被DAPI溶液用于核，然后由Fluromount-G安装。奥林巴斯BX-53直立或蔡司LSM 710共聚焦显微镜对幻灯片进行了检查。使用 ImageJ 完成了图像分析。为了评估肿瘤血管密度，对CD31-阳性区域进行了测量，并与肿瘤区域进行规范化。为了分析血管回归，对胶原蛋白IV阳性区域进行了测量，并除以CD31阳性区域，如先前报告24。

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结果 (简体中文) 3:[复制]

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小鼠组织的免疫荧光分析 为了分析新生视网膜血管的形态发生，在4%多聚甲醛（Sigma）中对眼睛进行了冰冻固定1小时，并在剥离视网膜前用PBS冲洗。在TNB缓冲液（0.5%阻断剂（PerkinElmer，FP1012）、150 mM NaCl、100 mM Tris HCl（pH 7.4）、0.4%Triton X-100）中于室温下阻断2 h后，视网膜与Alexa-Fluor共轭隔离素B4（Invitrogen，I21411，20 μg ml-1 in TNB）和一级抗体（如果需要）在4 C下过夜。抗胶原IV（AbD Serotec，2150-1470，1:400）、抗ERG（Abcam，Ab92513，1:200）或FOXO1（细胞信号技术，2880，1:100），然后依次应用Alexa Fluor 546结合二级抗体（Invitrogen，1:400）。随后，用Fluromount-G（Invitrogen）平贴视网膜，用Olympus FV1000或蔡司LSM 710共聚焦显微镜进行检查。为了用EdU标记增殖内皮细胞，实验前3小时，给幼犬注射60μl EdU（Invitrogen，C10338，0.5 mg ml 1 in PBS）。EdU检测采用Click-itedu细胞增殖成像试剂盒（Invitrogen，C10338）。根据制造商的指示，用原位细胞死亡检测试剂盒TMR-red（Roche）对视网膜进行染色，以检测凋亡的ECs。 在植入肿瘤试验中，小鼠组织在4°C下固定在4%多聚甲醛中过夜，在PBS中洗涤，在30%蔗糖中平衡过夜，嵌入OCT（樱花），在5μm处切片。载玻片在PBS中用0.2%Triton X-100处理，并在室温下在封闭溶液（1%BSA，5%山羊血清在PBS中）中孵育1 h。抗CD31（BD Biosciences，553370，1:200）和抗胶原IV（AbD Serotec，2150-1470，1:200）的一级抗体在4°C下孵育过夜，随后用Alexa Fluor 488-和Alexa Fluor 546结合二级抗体（Invitrogen，1:400）在室温下孵育2小时。样品经DAPI核染色，Fluromount-G固定，Olympus BX-53直立显微镜或蔡司LSM 710共聚焦显微镜检查。图像分析用ImageJ完成。为评估肿瘤血管密度，测量CD31阳性面积并与肿瘤面积进行标准化。为分析血管回归，测量IV型胶原阳性面积，并除以先前报告的CD31阳性面积24。

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